熒光顯微鏡，也就是這么回事

　　在諸多顯微鏡的觀察模式中，明場成像得到的是光強度zui直接的變化，相差成像等技術也大多是將光的相位差等轉變為強度差，使人眼能夠感受到。熒光成像技術則是特異性地區分出光的波長，也就是光的顏色，使人眼能夠區分。

　　光被人眼所看到分為兩種形式：發光和反光。明場成像屬于反光形式，熒光則屬于發光形式。

　　物體獲得能量后可能產生發光現象，能量來源可能是熱能（如白熾燈），化學能（如螢光）或者核能（如陽光），而熒光的能量來源則是另一束能量更高的光。

　　高能量的光子與電子碰撞，使得電子從基態躍遷到激發態。激發態的電子很不穩定，會重新回落到基態，這個過程中會消耗部分熱能，并發出新的光子。新的光子能量比zui初的光子能量低，因此波長更長。由于新的光子波長區別于入射光的光子波長，通過一定的光學處理方法將兩束不同波長的光分開，從而使我們只看到發射出來的新光子（熒光信號），也就是熒光顯微鏡看到的熒光圖像。

　　具有熒光特性的物質叫熒光素，不同的熒光素對不同波長的入射光激發效率不同，這種差異體現在熒光素的激發光譜上。同樣的，不同熒光素發射出的新光子波長也不同，這種差異體現在熒光素的發射光譜上。因此，了解一種熒光素的實驗方法，主要是了解其激發和發射光譜，其中發射光譜是熒光素的特征光譜。

　　實現入射光與發射光分離的部分是熒光顯微鏡的核心，通常采用三片濾光片結構。

　　以白光作為激發光源時，利用*塊激發光濾光片將白光過濾，使熒光素對應的zui適激發波長的光透過。二向色鏡是這個結構的核心，它負責將入射光與發射熒光分開，使入射光反射進入物鏡，照射到樣本上，樣本中的熒光素便被激發產生熒光，發射出來的熒光被物鏡收集后，穿過二向色鏡。熒光再通過發射光濾光片，選擇具有特征性的發射光范圍，zui終進入目鏡或者成像設備中。

　　以上的結構是常見的熒光顯微鏡成像光路，也被稱作反射熒光光路。

　　熒光照明的光源有很多種，理論上普通的白光光源也可以，但是實際上因為熒光的激發效率很低，因此需要亮度足夠的光源。目前常用的熒光光源有4種：

　　汞燈：汞蒸氣激發光源，傳統熒光光源。

　　氙燈：氙弧光燈，光譜連續且強度平均。

　　激光：單色性好，強度高。

　　LED：壽命長，單色性較好，亮度高，是今后光源的主要發展方向。

　　熒光成像的優勢：

　　通過二向色鏡將入射光和熒光區分開，使我們只看到熒光信號，沒有其他光線的干擾，因此可以看到很微弱的信號，比如單分子熒光。

　　因為熒光素可以特異性地標記到不同的細胞或分子上，因此可以區分不同的細胞或分子。

　　不同強度的熒光可以進行比較，從而實現細胞或分子的定量分析。

　　目前更的顯微鏡系統，如共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、超高分辨率顯微鏡、光切片顯微鏡等都是利用熒光成像方法進行觀察和分析的。